本发明公开了一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌,其是菌株的aroA基因缺失第394131- 394631 位核苷酸和omp2基因缺失181258- 181643位核苷酸的双基因缺失株,菌株保藏号为:CCTCC NO:M2013460。本发明主要是利用现代基因工程原理和分子生物学手段对Hps潜在的毒力因子aroA基因和omp2基因进行缺失,构建Hps不含抗性标记的双基因缺失菌株,并对其生物学特性及致病力等进行探讨,为进一步研制新型高效可提供高交叉保护效力的基因工程活疫苗打下基础。
1.一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌,其特征在于:其是菌株的aroA基因缺失第394131-xa0394631核苷酸和omp2基因缺失181258-xa0181643位核苷酸的双基因缺失株,菌株保藏号为:CCTCCxa0NO:xa0M2013460。
2.一种如权利要求1所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法,其特征在于,其步骤如下:A)基因的克隆与重组自杀性质粒的构建:参照GenBank中aroA、omp2基因的序列,从H10中扩增了aroA和omp2基因的上下游片段;将得到的上下游片段,连接到携带蔗糖敏感基因(SacB)的自杀性质粒pEMOC2上,构建缺失第394131-xa0394631位核苷酸的aroA基因的重组自杀性质粒pEMΔaroA和缺失第181258-xa0181643位核苷酸的omp2基因的重组自杀性质粒pEMΔomp2;B)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建:以转化了上述重组自杀性质粒pEMΔaroA的大肠杆菌β2155为供体菌,血清5型菌株H10为受体菌进行接合转移后,涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上,筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子,进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中,鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生,涂布含10%蔗糖的平皿,并转印到Cm平皿上,筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆,并进行第二次PCR鉴定,确定重组自杀性质粒已经丢失,从而构建出aroA基因缺失第394131-xa0394631xa0位核苷酸的单基因缺失株HS02;C)副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建:用转化了上述重组自杀性质粒pEM?omp2的大肠杆菌β2155为供体菌,上述单基因缺失株HS02为受体菌进行接合转移后,涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上,筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子,进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中,鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生,涂布含10%蔗糖的平皿,并转印到Cm平皿上,筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆,并进行第二次PCR鉴定,确定重组自杀性质粒已经丢失,从而构建aroA基因缺失第394131-xa0394631位基因和omp2基因缺失181258-xa0181643双基因缺失的菌株。
3.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于:步骤B)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建过程中,第一次PCR鉴定时,所用的上游引物为SEQxa0IDxa0NO:5,下游引物为SEQxa0IDxa0NO:6;第二次PCR鉴定上游引物为SEQxa0IDxa0NO:7,下游引物为SEQxa0IDxa0NO:8。
4.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于,步骤C)副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建中,第一次PCR鉴定时,上游引物为SEQxa0IDxa0NO:9,下游引物为SEQxa0IDxa0NO:10,第二次PCR鉴定上游引物为SEQxa0IDxa0NO:7,下游引物为SEQxa0IDxa0NO:8。
5.根据权利要求3或4所述的构建方法,其特征在于,所述基因的克隆与重组自杀性质粒的构建具体步骤如下:1)Hps的增殖及其基因组的提取:取冻干保存的副猪嗜血杆菌接种于TSB振摇培养过夜;再取菌液划线于含有NAD的TSA平板和不含NAD的TSA平板,于37°C培养箱倒置培养过夜;取上述菌液至EP管中,离心后弃上清,倒置EP管于吸水纸上吸干管中残余水分;沉淀重悬于TE中,加入溶菌酶置于35-42°C水浴中作用1-2小时;加入NaCl溶液、10%SDS溶液、20mg/mL蛋白酶K,48-52°C水浴中作用2-4h;用枪头将混合液均分到两个新的EP管中,加入与菌液等体积的酚、氯仿以及异戊醇的混合液抽提两次;抽提后用异丙醇于-15°C以下的冰箱中沉淀,离心后弃上清,用预冷的乙醇洗涤两次;室温干燥后,用含20μg/mLxa0RNAasexa0的TE溶解DNA,用于PCR反应中作模板;2)核酸物质的胶回收纯化:上述DNA注入琼脂糖凝胶的梳空内,放入电泳槽中电泳15-20min;在紫外灯下切下所需的目的片段,然后放入离心管中,加入等倍凝胶体积的Bindingxa0Buffer,把混合物置于55°C~65°C水浴中温浴凝胶完全融化;将DNA-琼脂糖溶液转移到HiBindDNA柱子中,并把HiBindDNA柱子装入收集管内,室温下离心处理,弃去滤液;将空柱子重新套回收集管中,离心甩干柱子中残余的液体;把柱子装在离心管上,加入洗脱液或灭菌水到柱子的膜中央上,离心后得到的溶液即纯化的DNA产物;3)大肠杆菌感受态细胞的制备:采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞;4)连接产物的转化:将上述大肠杆菌感受态细胞加入纯化的DNA产物,轻轻旋转以混匀内溶物,冰浴后于37-45°C的水浴中热激后;快速转移到冰浴中,使细胞冷却;加入SOC培养基,于摇床上摇动细胞使细菌复壮;取复壮的菌液平铺到含有相应抗生素的LB琼脂培养基上,待液体被完全吸干之后于35-42°C倒置培养;5)质粒的制备:将步骤4)中导致培养后的肠杆菌接种于含有抗生素的液体培养基中,摇床中振摇培养;将菌液分装到EP管中,室温下离心后弃掉上清,收集菌体;加入SollutionI/RNase混合液,充分重悬管底的细胞沉淀;往细胞悬液中加入SollutionII,颠倒EP管3-6次,往混合液中加入SollutionIII,颠倒数次至混匀,直到形成白色絮状沉淀;室温下连续离心处理,弃去滤液,将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,室温下离心以甩干柱子;将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,往DNA结合膜中央加入Elutionxa0Buffer或无菌双蒸水,室温下静置,离心,管底的洗脱液即所需的质粒溶液;6)重组质粒的鉴定:采用PCR快速鉴定法或常规鉴定法多上述质粒溶液进行鉴定,挑选鉴定结果为阳性的克隆子接种于含抗生素的液体培养基中,培养,然后用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,抽提出来的质粒溶液用限制性核酸内切酶酶切消化,消化后于0.8%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察酶切产生的条带;7)菌株H10xa0aroA、omP2基因前后壁的克隆:参照Hpsxa0SH0165中aroA基因及上游和下游序列分别设计aroA前臂的上游引物SEQxa0IDxa0NO:1、下游引物SEQxa0IDxa0NO:2和aroA后臂的上游引物SEQxa0IDxa0NO:3、下游引物SEQxa0IDxa0NO:4,分别扩增aroA基因的前臂和后臂,其中前臂的上游引物SEQxa0IDxa0NO:1上加入酶切位点NotI,下游引物SEQxa0IDxa0NO:2上加入酶切位点BglII;后臂的上游引物SEQxa0IDxa0NO:3加入酶切位点BglII,下游引物SEQxa0IDxa0NO:4加入酶切位点SalI;前臂的上游引物SEQxa0IDxa0NO:1位于aroA的上游基因ppc上,下游引物SEQxa0IDxa0NO:2位于aroA基因的上游,PCR扩增出的片段ΔaroA-UP大小为710bp,横跨ppc基因和aroA基因;后臂的上游引物ΔaroA-3位于aroA基因的下游,下游引物ΔaroA-4位于aroA基因的下游基因cspD上,扩增出的片段ΔaroA-DN大小为1281bp;PCR扩增出来的产物经胶回收试剂盒回收纯化之后,与pMD18-T连接,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂布含有氨苄青霉素的LB平板,构建质粒pMD18-T-ΔaroA-UP和pMD18-T-ΔaroA-DN;平板上长出来的菌落经PCR鉴定,质粒pMD18-T-ΔaroA-UP用引物SEQxa0IDxa0NO:1/xa0SEQxa0IDxa0NO:2反应,pMD18-T-ΔaroA-DN用SEQxa0IDxa0NO:3和SEQxa0IDxa0NO:4反应,PCR结果为阳性的克隆子抽提质粒进行酶切鉴定,pMD18-T-ΔaroA-UP先用NotI和BglII双酶切鉴定,再用NotI和SalI双酶切鉴定;pMD18-T-ΔaroA-DN用BglII和SalI双酶切鉴定;酶切产生正确片段的克隆子测序;8)中间转移质粒pMD18-T-ΔaroA、pMD18-T-ΔompP2的构建及鉴定:步骤7)中测序正确的克隆子抽提质粒,质粒pMD18-T-ΔaroA-UP经BglII和SalI双酶切回收线性pMD18-T-ΔaroA-UP,质粒pMD18-T-ΔaroA-DN经BglII和SalI双酶切之后回收ΔaroA-DN,再将有着相同黏性末端的线性pMD18-T-ΔaroA-UP与ΔaroA-DN用T4连接酶连接起来,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂布含有氨苄青霉素的LB平板,构建成中间质粒pMD18-T-ΔaroA;平板上长出来的菌落经PCR鉴定,用引物SEQxa0IDxa0NO:1和SEQxa0IDxa0NO:4反应,结果为阳性的克隆子抽提质粒用NotI和SalI双酶切鉴定;酶切产生正确片段的克隆子测序;9)重组自杀性质粒pEMΔaroA、pEMΔomP2的构建:xa0测序正确的克隆子抽提质粒,并用NotI和SalI双酶切,回收片段ΔaroA-UP-DN,自杀性pEMOC2同样用NotI和SalI双酶切,回收大片段,再将ΔaroA-UP-DN与pEMOC2用T4连接酶连接过夜,构建自杀性质粒pEMΔaroA,转化大肠杆菌β2155,涂布含有Cm和DAP的LB平板,挑取长出来的单菌落进行PCR鉴定,用引物SEQxa0IDxa0NO:1和SEQxa0IDxa0NO:4反应,结果为阳性的菌落抽提质粒NotI和SalI双酶切鉴定。
6.根据权利要求5所述的构建方法,其特征在于,步骤5)中,室温下连续离心处理具体步骤为:室温下离心1min;将滤液重新过一次HiBindxa0DNA结合柱;弃掉滤液,将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,加入HBxa0Buffer,室温下离心1min,弃去滤液;将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,加入DNAxa0Washxa0Buffer,室温下离心1min,弃去滤液;重复上述步骤一次,弃去滤液,将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管。
7.一种利用权利要求1所述的双基因缺失的副猪嗜血杆菌制备的预防副猪嗜血杆菌病的疫苗。技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌及其构建方法。
背景技术
副猪嗜血杆菌病是近年来严重危害养猪业的新发细菌性传染病,引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜脑炎等,发病率一般为10-15%,死亡率可达50%以上,引起了人们的日益重视。该病的致病菌副猪嗜血杆菌(Hps)的血清型复杂多样,按Kieleetin.Rapp-Gbarideosn(KRG)琼脂扩散血清分型方法,至少可将Hps分为15个血清型,另有20%以上的分离株血清型不可定。己有的资料表明,Hps具有明显的地方性特征,基于某个或某些特定血清型菌株的全菌体制备的灭活疫苗在不同血清型之间所产生的交叉保护率很低,急待研制具有高效交叉保护力的疫苗。因此弱毒活疫苗的研制是当前多数传染病的研究热点。目前关于Hps的致病机理尚不清楚,aroA基因和omp2基因被认为是Hps的潜在毒力基因,在其它细菌中有较深的研究报道。aroA基因是细菌芳香族氨基酸代谢通路中一个非常重要的酶,该酶活性的缺失会导致细菌毒力降低等生物学变化,已被应用于多种细菌的缺失弱毒疫苗的构建。omp2在流感嗜血杆菌定殖中发挥重要作用,且已被证实与人的粘蛋白的特定成分结合,是细菌侵入机体过程中一个重要的因子。
发明内容
本发明主要是利用现代基因工程原理和分子生物学手段对Hps潜在的毒力因子aroA基因和omp2基因进行缺失,构建Hps不含抗性标记的双基因缺失菌株,并对其生物学特性及致病力等进行探讨,为进一步研制新型高效可提供高交叉保护效力的基因工程活疫苗打下基础。本发明的目的在于提供一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌,构建一种副猪嗜血杆菌的变异株,用于制备预防副猪嗜血杆菌病灭活疫苗。本发明的另一目的在于双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法。本发明的又一目的在于双基因缺失的副猪嗜血杆菌在制备预防副猪嗜血杆菌病灭活疫苗中的应用。为解决上述问题,本发明所采用的技术方案如下:一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌,其是菌株的aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的双基因缺失株,菌株保藏号为:CCTCCxa0NO:M2013460。该菌株于2013年9月29日由中国典型培养物保藏中心接受保藏,并于2013年10月9日检测存活,该菌株保藏名称为副猪嗜血杆菌GD-1;保藏中心地址为中国武汉,武汉大学,邮编为430072。一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌的构建方法,其步骤如下:A)基因的克隆与重组自杀性质粒的构建:参照GenBank中aroA、omp2基因的序列,从H10中扩增了aroA和omp2基因的上下游片段。将得到的上下游片段,连接到携带蔗糖敏感基因(SacB)的自杀性质粒pEMOC2上,构建缺失了第394131-394631位核苷酸的aroA基因的重组自杀性质粒pEMΔaroA和第181258-181643位核苷酸的omp2基因的重组自杀性质粒pEMΔomP2;B)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建:以转化了上述重组自杀性质粒pEMΔaroA的大肠杆菌β2155为供体菌,血清5型菌株H10为受体菌进xa0行接合转移后,涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上,筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子,进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中,鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生,涂布含10%蔗糖的平皿,并转印到Cm平皿上,筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆,并进行第二次PCR鉴定,确定发重组自杀性质粒已经丢失,从而构建出aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸的单基因缺失株HS02;C)副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建:用转化了上述重组自杀性质粒pEMΔomp2的大肠杆菌β2155为供体菌,上述单基因缺失株HS02为受体菌进行接合转移后,涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并转印到含10%蔗糖的平皿上,筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子,进行第一次PCR鉴定重组自杀性质粒已经整合到染色体中,鉴定正确的接合子在不含NaCl的培养基中培养促使第二次同源重组的发生,涂布含10%蔗糖的平皿,并转印到Cm平皿上,筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆,并进行第二次PCR鉴定,确定发重组自杀性质粒已经丢失,从而构建构建aroA基因缺失第394131-394631位基因和omp2基因缺失181258-181643双基因缺失的菌株。上述构建方法中,步骤B)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建过程中,第一次PCR鉴定时,所用的上游引物为SEQxa0IDxa0NO:5,下游引物为SEQxa0IDxa0NO:6;第二次PCR鉴定上游引物为SEQxa0IDxa0NO:7,下游引物为SEQxa0IDxa0NO:8。上述构建方法中,步骤C)副猪嗜血杆菌双基因缺失株的构建中,第一次PCR鉴定时,上游引物为SEQxa0IDxa0NO:9,下游引物为SEQxa0IDxa0NO:10,第二次PCR鉴定上游引物为SEQxa0IDxa0NO:7,下游引物为SEQxa0IDxa0NO:8。上述构建方法中,所述基因的克隆与重组自杀性质粒的构建具体步骤如下:1)Hps的增殖及其基因组的提取:取冻干保存的副猪嗜血杆菌接种于TSB振摇培养过夜;再取菌液划线于含有NAD的TSA平板和不含NAD的TSA平板,于37°C培养箱倒置培养过夜;取上述菌液至EP管中,离心后弃上清,倒置EP管于吸水纸上吸干管中残余水分;沉淀重悬于TE中,加入溶菌酶置于35-42°C水浴中作用1-2小时;加入NaCl溶液、10%SDS溶液、20mg/mL蛋白酶K,48-52°C水浴中作用2-4h;用枪头将混合液均分到两个新的EP管中,加入与菌液等体积的酚、氯仿以及异戊醇的混合液抽提两次;抽提后用异丙醇于-15°C以下的冰箱中沉淀,离心后弃上清,用预冷的乙醇洗涤两次;室温干燥后,用含20μg/mLxa0RNAase的TE溶解DNA,用于PCR反应中作模板;2)核酸物质的胶回收纯化:上述DNA注入琼脂糖凝胶的梳空内,放入电泳槽中电泳15-20min;在紫外灯下切下所需的目的片段,然后放入离心管中,加入等倍凝胶体积的Bindingxa0Buffer,把混合物置于55°C~65°C水浴中温浴凝胶完全融化;将DNA-琼脂糖溶液转移到HiBindDNA柱子中,并把HiBindDNA柱子装入收集管内,室温下离心处理,弃去滤液;将空柱子重新套回收集管中,离心甩干柱子中残余的液体;把柱子装在离心管上,加入洗脱液或灭菌水到柱子的膜中央上,离心后得到的溶液即纯化的DNA产物;3)大肠杆菌感受态细胞的制备:采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞;4)连接产物的转化:将上述大肠杆菌感受态细胞加入纯化的DNA产物,轻轻旋转以混匀内溶物,冰浴后于37-45°C的水浴中热激后;快速转移到冰浴中,使细胞冷却;加入SOC培养基,于摇床上摇动细胞使细菌复壮;取复壮的菌液平铺到含有相应抗生素的LB琼脂培养基上,待液体被完全吸干之后于35-42°C倒置培养;5)质粒的制备:将步骤4)中导致培养后的肠杆菌接种于含有抗生素的液xa0体培养基中,摇床中振摇培养;将菌液分装到EP管中,室温下离心后弃掉上清,收集菌体;加入SollutionI/RNase混合液,充分重悬管底的细胞沉淀;往细胞悬液中加入SollutionII,颠倒EP管3-6次,往混合液中加入SollutionIII,颠倒数次至混匀,直到形成白色絮状沉淀;室温下连续离心处理,弃去滤液,将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,室温下离心以甩干柱子;将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,往DNA结合膜中央加入Elutionxa0Buffer或无菌双蒸水,室温下静置,离心,管底的洗脱液即所需的质粒溶液;6)重组质粒的鉴定:采用PCR快速鉴定法或常规常规鉴定法多上述质粒溶液进行鉴定,挑选鉴定结果为阳性的克隆子接种于含抗生素的液体培养基中,培养,然后用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,抽提出来的质粒溶液用限制性核酸内切酶酶切消化,消化后于0.8%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察酶切产生的条带;7)菌株H10aroA、omP2基因前后壁的克隆:参照Hpsxa0SH0165中aroA基因及上游和下游序列分别设计aroA前臂的上游引物SEQxa0IDxa0NO:1、下游引物SEQxa0IDxa0NO:2和aroA后臂的上游引物SEQxa0IDxa0NO:3、下游引物SEQxa0IDxa0NO:4,分别扩增aroA基因的前臂和后臂,其中前臂的上游引物SEQxa0IDxa0NO:1上加入酶切位点NotI,下游引物SEQxa0IDxa0NO:2上加入酶切位点BglII;后臂的上游引物SEQxa0IDxa0NO:3加入酶切位点BglII,下游引物SEQxa0IDxa0NO:4加入酶切位点SalI。前臂的上游引物SEQxa0IDxa0NO:1位于aroA的上游基因ppc上,下游引物SEQxa0IDxa0NO:2位于aroA基因的上游,PCR扩增出的片段ΔaroA-UP大小为710bp,横跨ppc基因和aroA基因;后臂的上游引物ΔaroA-3位于aroA基因的下游,下游引物ΔaroA-4位于aroA基因的下游基因cspD上,扩增出的片段ΔaroA-DN大小为1281bp;PCR扩增出来的产物经胶回收试剂盒回收纯化之后,与pMD18-Txa0连接,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂布含有氨苄青霉素的LB平板,构建质粒pMD18-T-ΔaroA-UP和pMD18-T-ΔaroA-DN;平板上长出来的菌落经PCR鉴定,质粒pMD18-T-ΔaroA-UP用引物SEQxa0IDxa0NO:1/SEQxa0IDxa0NO:2反应,pMD18-T-ΔaroA-DN用SEQxa0IDxa0NO:3和SEQxa0IDxa0NO:4反应,PCR结果为阳性的克隆子抽提质粒进行酶切鉴定,pMD18-T-ΔaroA-UP先用NotI和BglII双酶切鉴定,再用NotI和SalI双酶切鉴定;pMD18-T-ΔaroA-DN用BglII和SalI双酶切鉴定;酶切产生正确片段的克隆子测序;8)中间转移质粒pMD18-T-ΔaroA、pMD18-T-ΔompP2的构建及鉴定:步骤7)中测序正确的克隆子抽提质粒,质粒pMD18-T-ΔaroA-UP经BglII和SalI双酶切回收线性pMD18-T-ΔaroA-UP,质粒pMD18-T-ΔaroA-DN经BglII和SalI双酶切之后回收ΔaroA-DN,再将有着相同黏性末端的线性pMD18-T-ΔaroA-UP与ΔaroA-DN用T4连接酶连接起来,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂布含有氨苄青霉素的LB平板,构建成中间质粒pMD18-T-ΔaroA;平板上长出来的菌落经PCR鉴定,用引物SEQxa0IDxa0NO:1和SEQxa0IDxa0NO:4反应,结果为阳性的克隆子抽提质粒用NotI和SalI双酶切鉴定;酶切产生正确片段的克隆子测序;9)重组自杀性质粒pEMΔaroA、pEMΔomP2的构建:测序正确的克隆子抽提质粒,并用NotI和SalI双酶切,回收片段ΔaroA-UP-DN,自杀性pEMOC2同样用NotI和SalI双酶切,回收大片段,再将ΔaroA-UP-DN与pEMOC2用T4连接酶连接过夜,构建自杀性质粒pEMΔaroA,转化大肠杆菌β2155,涂布含有Cm和DAP的LB平板,挑取长出来的单菌落进行PCR鉴定,用引物SEQxa0IDxa0NO:1和SEQxa0IDxa0NO:4反应,结果为阳性的菌落抽提质粒NotI和SalI双酶切鉴定。步骤5)中,室温下连续离心处理具体步骤为:室温下离心1min;将滤液xa0重新过一次HiBindxa0DNA结合柱;弃掉滤液,将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,加入HBxa0Buffer,室温下离心1min,弃去滤液;将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,加入DNAxa0Washxa0Buffer,室温下离心1min,弃去滤液;重复上述步骤一次,弃去滤液,将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管。一种利用上述双基因缺失的副猪嗜血杆菌制备的预防副猪嗜血杆菌病的疫苗。所述疫苗含有a含有aroA基因缺失第394131-394631位核苷酸和omp2基因缺失181258-181643位核苷酸的双基因缺失副猪嗜血杆菌。相比现有技术,本发明的有益效果在于:本发明利用现代基因工程原理和分子生物学手段对Hps潜在的毒力因子aroA基因和omp2基因进行缺失,构建Hps不含抗性标记的双基因缺失菌株,并对其生物学特性及致病力等进行探讨,为进一步研制新型高效可提供高交叉保护效力的基因工程活疫苗打下基础;本发明通过双基因缺失株对豚鼠的免疫试验及攻毒保护试验,双基因缺失的弱毒菌株HS03在豚鼠中的免疫效力优于传统灭活疫苗。下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。
附图说明
图1位副猪嗜血杆菌SH0165aroA基因及其上下游基因相对位置示意图;图2为中间质粒18T-ΔaroA-UP-DN的构建示意图;图3为自杀性质粒pEM-ΔaroA-UP-DN的构建示意图;图4为自杀性质粒pEM-Δomp2-UP-DN的构建示意图;图5为单基因缺失株HS02的构建路线图;图6为aroA基因前后臂片段的扩增结果图,其中A为aroA前臂扩增结果,B为aroAxa0gene后臂扩增结果;图7为aroA基因前后臂片段的克隆酶切鉴定结果图,A为pMD18-T-ΔaroA-UP鉴定结果,B为pMD18-T-ΔaroA-DN鉴定结果图8为质粒18T-ΔaroA-UP酶切鉴定结图果,A为pMD18-T-ΔaroAxa0PCR鉴定结果,B1为pMD18-T-ΔaroA(NotI+SalI)鉴定结果,B2为pMD18-T-ΔaroA(NotI+BglII)R鉴定结果,B3为pMD18-T-ΔaroA(BglII+SalI)R鉴定结果;图9为质粒pEMOC2-ΔaroA-UP酶切鉴定结果图,A1-2为pEMOC2双酶切(NotI+SalI)结果,A3-4:为pMD18-T-ΔaroA双酶切(NotI+SalI)结果,B1-3为pEMOC2-ΔaroA双酶切(NotI+SalI)结果;图10为omp2基因前臂片段的扩增结果图;图11为omp2基因后臂片段的扩增结果图;图12为质粒p18T-Δomp2酶切鉴定结果图,1为pMD18-T-Δomp2(NotI+SalI)结果,2为pMD18-T-Δomp2(NotI+BglII)结果,3为pMD18-T-Δomp2(BglII+SalI)结果;图13为质粒pEMOC2-Δomp2酶切鉴定结果,1-3:pEMOC2-Δomp2双酶切(NotI+SalI)结果;图14为质粒pEMOC2-Δomp2PCR鉴定结果;图15为扩增Cm基因鉴定接合子电泳结果图;图16为引物paroA-1和paroA-2PCR鉴定ΔaroA单交换接合子电泳结果图;图17为引物paroA-1和paroA-2PCR鉴定ΔaroA缺失株电泳结果图;图18为引物paroA-1和paroA-2PCR鉴定ΔaroA缺失株HS02的稳定性电泳结果图;图19为引物pxa0omp2-1和pxa0omp2-1PCR鉴定Δomp2单交换接合子电泳结果图;图20为引物pxa0omp2-1和pxa0omp2-2PCR鉴定Δomp2缺失株电泳图;图21为引物pxa0omp2-1和pxa0omp2-2PCR鉴定Δomp2缺失株HS03的稳定性电泳图;图22为突变株和亲本株的生长曲线图;图23为用HPS引物扩增鉴定接种豚鼠回收的HPS后的电泳图。
具体实施方式
在本发明中,大肠杆菌DH5α由本试验室保存;PCR产物克隆载体pMD18-T购自大连宝生物公司;本发明中所采用的所有引物见表1。表1:本发明所用引物编号 引物名称 序列及酶切位点 SEQxa0IDxa0NO:11 16Sxa0rRNA-1 5’-GTGATGAGGAAGGGTGGTGT-3’ SEQxa0IDxa0NO:12 16Sxa0rRNA-2 5’-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3’ SEQxa0IDxa0NO:5 aroA-1 5’-AAATGCTCAATGCCTTGAAAGC-3’ SEQxa0IDxa0NO:6 aroA-2 5’-AAATTATTTTTCTTCCCTACT-3’ SEQxa0IDxa0NO:1 ΔaroA-1 5’-AAAGCGGCCGCGAAGGGCAATTAATGGCGGA-3’ SEQxa0IDxa0NO:2 ΔaroA-2 5’-AATAGATCTCCGCTTGCAATAACGCATCA-3’ SEQxa0IDxa0NO:3 ΔaroA-3 5’-AATAGATCTTCAAGGCGACCGCTTGTTTG-3’ SEQxa0IDxa0NO:4 ΔaroA-4 5’-AAAGTCGACACACGCCAAATGCTTCTGCT-3’ SEQxa0IDxa0NO:9 Omp2-1 5’-ATGCCTTTGCGAAGAGC-3’ SEQxa0IDxa0NO:10 Omp2-2 5’-TTACCAAGTATAACTG-3’ SEQxa0IDxa0NO:13 ΔOmp2-1 5’-AAAxa0GCGGCCGCGCATCTAATTTGCATG-3’ SEQxa0IDxa0NO:14 ΔOmp2-2 5’-AATxa0AGAxa0TCTCCATCATCCTCAT-3’ SEQxa0IDxa0NO:15 ΔOmp2-3 5’-AATxa0AGAxa0TCTxa0TATATGATAGCTTG-3’ SEQxa0IDxa0NO:16 ΔOmp2-4 5’-AAAxa0GTCGACxa0TTACCAAGTATAAC-3’ SEQxa0IDxa0NO:7 Cm-1 5’-TTTCAGGAGCTAAGGAAG-3’ SEQxa0IDxa0NO:8 Cm-2 5’-CACCAATAACTGCCTTAA-3’ 实施例1一种双基因缺失的副猪嗜血杆菌,通过以下方法构建而成:1)菌株H10PCR鉴定:参照Oliveira,S.等人于2001建立的PCR鉴定Hps的方法,合成一对引物SEQxa0IDxa0NO:11和SEQxa0IDxa0NO:12,以培养过夜的菌液作为模版扩增16Sxa0rRNA片段,PCR反应体系为25μL:10xTaqbuffer2.5μL、2mmol/Lxa0dNTPs0.5μL、16Sxa0rRNA-1和16Sxa0rRNA-2(10μmol/L)各1μL、Taqase0.5μL,模板lμL,ddH2O定容至25μL。PCR反应程序为:94°C4min,然后进入PCR循环:94°C30s、58°C30s、72°C1min,30个循环;最后再72°C延伸10min;扩增产物经0.8%琼脂凝胶电泳鉴定,紫外灯下观察;扩增出来一条单一的条带,大小约为800bp,与预期的821bp的片段一致,证明菌株H10确实为副猪嗜血杆菌;2)Hps的增殖及其基因组的提取:取冻干保存的副猪嗜血杆菌H10接种于TSB于37°C振摇培养过夜;再取少量菌液划线于含有NAD的TSA平板和不含NAD的TSA平板,于37°C培养箱倒置培养过夜;如果不含NAD的TSA平板上没有菌落长出,就从含有NAD的TSA平板上挑取一个单菌落到含有TSB液体培养中振摇培养6-8h;取上述菌液1.5mL至EP管中,4°C12000rpm离心5min,弃上清,倒置EP管于吸水纸上吸干管中残余水分;沉淀重悬于1.5mLTE中,加入50mg/mL的溶菌酶9μL,37°C水浴中作用2h;加入2Mxa0NaCl溶液75μL,10%SDS溶液165μL,20mg/mL蛋白酶K3μL,50°C水浴中作用3h;用粗口的枪头将混合液均分到两个新的EP管中,加入与菌液等体积的酚、氯仿和异戊醇的混合液(酚、氯仿和异戊醇的体积比为100:99:1)抽提两次;用0.6倍体积与菌液的异丙醇于-20°C冰箱中沉淀30min以上;13000rpm离心15min,弃上清,用预冷的70%乙醇400μL洗涤两次;室温干燥后,用50μ含20μg/mL的RNAase的LTE溶解DNA,于-20°C保存,于PCR反应中作模板;3)核酸物质的胶回收纯化:用TAE配置浓度为1%是琼脂糖凝胶,将核酸物质注入琼脂糖凝胶的梳空内,放入电泳槽中电泳15-20min;在紫外灯下切下xa0所需的目的片段,然后放入离心管中,并近似的求出凝胶的体积,加入等倍凝胶体积的Bindingxa0Buffer,把混合物置于55°C~65°C水浴中温浴凝胶完全融化;将DNA-琼脂糖溶液转移到一个HiBindDNA柱子中,并把柱子装在一个干凈的2ml收集管内,室温下10000rpm离心1min,弃去液体;将柱子重新套回收集管中,再加入300μlxa0Bindingxa0Buffer,室温下10000rpm离心1min,弃去滤液;将柱子重新套回收集管中,加入700μlxa0SPWxa0Washxa0buffer,室温下,10000rpm离心1min,弃去滤液;将柱子重新套回收集管中,重复加入700μlxa0SPWxa0Washxa0buffer,室温下10000rpm离心1min,弃去滤液;将空柱子重新套回收集管中,10000rpm离心1min以甩干柱子中残余的液体;把柱子装在一个干凈的1.5ml离心管上,加入30~50μl洗脱液或灭菌水到柱子的膜中央上,10000rpm离心1min,离心管中的溶液就是纯化的DNA产物,保存于-20度;4)氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞:于37°C培养16-20h的新鲜平板中挑取一个单菌落,转到一个含有100mlxa0LB培养基的1L烧瓶中,放入37°C300rpm/min的旋转摇床中剧烈振摇培养约3h;期间每隔20-30min测量菌液OD600值来监测培养物的生长情况,当OD600约为0.4时既可作为制备感受态细胞的菌液;在无菌条件下将细菌转移到一个无菌的用冰预冷过的50ml聚丙烯管中,冰浴10min;于4°C4000rpm/min离心10min,以回收细胞;弃去上清液,将管倒置1min以使最后残留的培养液流尽;用10ml以冰预冷的0.1mol/Lxa0CaCl2重悬管底细胞,冰浴10min;于4°C4000rpm/min离心10min,以回收细胞;弃去培养液,将管倒置1min以使最后残留的培养液流尽;每50ml初始培养物用2ml预冷的0.1mol/Lxa0CaCl2重悬细胞沉淀并分装成100μl的小分,于-80°C冻存备用;5)连接产物的转化:从-80°C取出分装的大肠杆菌感受态细胞于37°C水浴xa0中快速融化,然后每管中加入DNA含量约为50ng的连接产物10μl,轻轻旋转以混匀内容物,冰浴30min;于42°C的水浴中热激90s,切记不要摇动;快速将管转移到冰浴中,使细胞冷却1-2min;每管加入900μL37°C的SOC培养基,于37°C摇床上,温和地摇动细胞45min使细菌复壮;取适当体积复壮的菌液平铺到含有相应抗生素的LB琼脂培养基上,待液体被完全吸干之后于37°C倒置培养12-16h;6)质粒的制备:提取质粒,将带有所需质粒的大肠杆菌接种于含有相应抗生素的液体培养基中,于37°C摇床中振摇培养12-16h;将菌液按2mL/管分装到EP管中,室温下10000×g离心1min弃掉上清,收集菌体;加入250μLxa0Sollutionxa0I/RNase混合液,充分重悬管底的细胞沉淀;往细胞悬液中加入250μLxa0Sollutionxa0II,轻轻颠倒EP管5次左右,时间不超过5min;往混合液中加入350μLxa0Sollutionxa0III,轻轻颠倒数次混匀,直到形成白色絮状沉淀;室温下,12000×g离心15min;将上清轻轻吸出,转移到2mL收集管的HiBindxa0DNA结合柱中,室温下10000×g离心1min;将滤液重新过一次HiBindxa0DNA结合柱;弃掉滤液,将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,加入500μLxa0HBxa0Buffer,室温下10000×g离心1min,弃去滤液;将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,加入700μLxa0DNAxa0Washxa0Buffer,室温下10000×g离心1min,弃去滤液;重复步骤离心一次;弃去滤液,将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,室温下10000×g离心2min以甩干柱子;将HiBindxa0DNA结合柱装回收集管,往DNA结合膜中央加入30μLxa0Elutionxa0Buffer或无菌双蒸水,室温下静置2min,10000×g离心1min,管底的洗脱液即所需的质粒溶液;7)重组质粒的鉴定:1克隆子鉴定:采用PCR快速鉴定法,用10μL枪头挑取转化子,放入无菌的EP管中,加入20μL灭菌蒸馏水,用10μL移液枪反复吹打,使枪头上的xa0菌体细胞脱落并溶于水中,再用振荡器涡旋均匀,将细胞悬浊液取出10μL保存于4°C冰箱,如鉴定结果为阳性则可以扩大培养,剩下的细胞悬液煮沸10min,再冰浴10min,12000r/min离心1min,取上清作为PCR模版进行PCR鉴定;2重组质粒的酶切鉴定:将经PCR鉴定为阳性的克隆子接种于3ml含相应抗生素的液体培养基中,37°C250r/min培养12h左右,然后用质粒小量抽提试剂盒抽提质粒,抽提出来的质粒溶液用相应的限制性核酸内切酶在适合的温度下酶切消化,消化所需时间后于0.8%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察酶切产生的条带;8)菌株H10aroA基因的鉴定:参照Hpsxa0SH0165中aroA基因序列设计一对引物aroA-1/aroA-2(见引物表),以培养过夜的H10株菌液作为模版扩增aroA基因;PCR反应体系为25μL:10xTaqbuffer2.5μL、2mmol/Lxa0dNTPs0.5μL、aroA-1和aroA-2(10μmol/L)各1μL、Taqase0.5μL,模板lμL,ddH20定容至25μL。PCR反应程序为:94°C4min,然后进入PCR循环:94°C30s、58°C30s、72°C1min,30个循环;最后再72°C延伸10min;扩增产物经0.8%琼脂凝胶电泳鉴定,紫外灯下观察;9)菌株H10aroA、omP2基因前后壁的克隆:参照Hpsxa0SH0165中aroA基因及上游和下游序列(NC_011852)设计两对引物ΔaroA-1/ΔaroA-2和ΔaroA-3/ΔaroA-4(见表1),分别扩增aroA基因的前臂和后臂;其中前臂的上游引物ΔaroA-1上加入酶切位点NotI(GCGGCCGC),下游引物ΔaroA-2上加入酶切位点BglII(AGATCT);后臂的上游引物ΔaroA-3加入酶切位点BglII(AGATCT),下游引物ΔaroA-4加入酶切位点SalI(GTCGAC)。前臂的上游引物ΔaroA-1位于aroA的上游基因ppc上,下游引物ΔaroA-2位于aroA基因的上游,扩增出的片段ΔaroA-UP大小为710bp,横跨ppc基因和aroA基因;xa0后臂的上游引物ΔaroA-3位于aroA基因的下游,上游引物ΔaroA-4位于aroA基因的下游基因cspD上,扩增出的片段ΔaroA-DN大小为1281bp,序列ΔaroA-UP与ΔaroA-DN中间的序列即为将要被缺失的片段ΔaroA,大小为500bp;PCR扩增出来的产物经胶回收试剂盒回收纯化之后,与pMD18-T连接,并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,涂布含有氨苄青霉素的LB平板,构建质粒pMD18-T-ΔaroA-UP和pMD18-T-ΔaroA-DN。平板上长出来的菌落经PCR鉴定,质粒pMD18-T-ΔaroA-UP用引物ΔaroA-1/ΔaroA-2反应,pMD18-T-ΔaroA-DN用ΔaroA-3/ΔaroA-4反应。PCR结果为阳性的克隆子抽提质粒进行酶切鉴定,pMD18-T-ΔaroA-UP先用NotI和BglII双酶切鉴定,再用NotI和SalI双酶切鉴定;pMD18-T-ΔaroA-DN用BglII和SalI双酶切鉴定,酶切产生正确片段的克隆子送上海生工生物工程有限公司测序;10)中间转移质粒pMD18-T-ΔaroA、pMD18-T-ΔompP2的构建:测序正确的克隆子抽提质粒,质粒pMD18-T-ΔaroA-UP经BglII和SalI双酶切回收大片段(即线性pMD18-T-ΔaroA-UP),质粒pMD18-T-ΔaroA-DN经BglII和SalI双酶切之后回收小片段(ΔaroA-DN),再将有着相同黏性末端的线性pMD18-T-ΔaroA-UP与ΔaroA-DN用T4连接酶连接起来,连接产物转化大肠杆菌DH5α,涂布含有氨苄青霉素(浓度)的LB平板,构建成中间质粒pMD18-T-aroA-UP-DN也即pMD18-T-ΔaroA;平板上长出来的菌落经PCR鉴定,用引物ΔaroA-1和ΔaroA-4反应;结果为阳性的克隆子抽提质粒用NotI和Salxa0I双酶切鉴定,酶切产生正确片段的克隆子送上海生工生物工程有限公司测序;11)重组自杀性质粒pEMΔaroA、pEMΔomP2的构建:测序正确的克隆子抽提质粒,并用NotI和SalI双酶切,回收小片段(即片段ΔaroA-UP-DN),自xa0杀性pEMOC2同样用NotI和SalI双酶切,回收大片段,再将ΔaroA-UP-DN与pEMOC2用T4连接酶连接过夜,以构建自杀性质粒pEM-ΔaroA-UP-DN即pEMΔaroA,转化大肠杆菌β2155,涂布含有Cm和DAP的LB平板;挑取长出来的单菌落进行PCR鉴定,用引物ΔaroA-1和ΔaroA-4反应;结果为阳性的菌落抽提质粒NotI和SalI双酶切鉴定;测序正确的omP2基因的上下游片段先后与PMD18T连接,构建中间转移质粒pMD18-T-ΔomP2,再用NotI和SalI双酶切切下连接好的大片段,连接到相同酶切的自杀性质粒pEMOC2上,转化大肠杆菌β2155,涂布Cm+DAP平皿,挑取转化子,小量制备质粒,PCR和酶切鉴定,构建缺失了384bp的omP2基因重组自杀性质粒pEMΔomP2;12)接合转移与副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建:用SacB反向筛选系统构建双基因缺失菌株;以转化了质粒pEMΔaroA的大肠杆菌β2155为供体,副猪嗜血杆菌HS01为受体进行接合转移;供体菌和受体菌分别在适合的琼脂平皿上培养过夜,然后用TSB洗两遍,调整菌浓度至OD600为0.8,各取100μl菌悬液混合,将无菌硝酸纤维滤膜贴于含DAP和NAD的TSA平板上,并于37°C预温,然后将混合菌液滴于滤膜上,使之慢慢吸收,37°C接合8小时,同时做供体和受体对照;然后用TSB洗下滤膜上菌液,重悬后在用TSB洗两遍,涂布含Cm和NAD的TSA平板,37°C培养过夜24小时;Cm抗性菌落分别影印到Cm抗性平板和10%蔗糖平板上;筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子进一步用PCR鉴定;第一次PCR反应(用引物aroA-1/aroA-2扩增)用来确定发生了第一次交换,第二次PCR反应(用引物Cm-1/Cm-2扩增)用来确定pEMOC2中的Cm表达盒的存在,从而说明转移质粒已经整合到副猪嗜血杆菌的染色体上了;将有正确PCR扩增带的接合子接种于无NaCl的TNB培养基中37°C震荡xa0培养过夜后,稀释适当的倍数涂布含有10%蔗糖的TNA平板,过夜培养后,挑取单菌落分别影印到Cm抗性平板和10%蔗糖平板上;这一次筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆,然后重复第一次PCR反应(用引物aroA-1/aroA-2扩增)和第二次PCR反应(用引物Cm-1/Cm-2扩增)进行PCR鉴定,以确定发生了第二次交换,构建缺失aroA的单缺失菌株HS02;13)副猪嗜血杆菌单基因缺失株的构建:供体菌和受体菌分别在适合的琼脂平皿上培养过夜,然后用TSB洗两遍,调整菌浓度至OD600为0.8,各取100μl菌悬液混合,将无菌硝酸纤维滤膜贴于含DAP和NAD的TSA平板上,并于37°C预温,然后将混合菌液滴于滤膜上,使之慢慢吸收,37°C接合8小时,同时做供体和受体对照;然后用TSB洗下滤膜上菌液,重悬后在用TSB洗两遍,涂布含Cm和NAD的TSA平板,37°C培养过夜24小时;Cm抗性菌落分别影印到Cm抗性平板和10%蔗糖平板上;筛选Cm抗性(CmR)蔗糖敏感(SurS)的接合子进一步用PCR鉴定;第一次PCR反应(用引物aroA-1/aroA-2扩增)用来确定发生了第一次交换,第二次PCR反应(用引物Cm-1/Cm-2扩增)用来确定pEMOC2中的Cm表达盒的存在,从而说明转移质粒已经整合到副猪嗜血杆菌的染色体上了;将有正确PCR扩增带的接合子接种于无NaCl的TNB培养基中37°C震荡培养过夜后,稀释适当的倍数涂布含有10%蔗糖的TNA平板,过夜培养后,挑取单菌落分别影印到Cm抗性平板和10%蔗糖平板上;这一次筛选出Cm敏感(CmS)蔗糖抗性(SurR)的克隆,然后重复第一次PCR反应(用引物aroA-1/aroA-2扩增)和第二次PCR反应(用引物Cm-1/Cm-2扩增)进行PCR鉴定,以确定发生了第二次交换,从而构建出aroA基因缺失第394131-394631位基因和omp2基因缺失181258-181643双基因缺失的菌株HS02。实施例2与实施例步骤相同,不同的是步骤7)中克隆子的鉴定采用常规法,挑取转化后长出来的单菌落,接种于3ml含相应抗生素的液体培养基中,37°C250r/min培养6h左右直到培养基变得浑浊;取100μL菌液,5000r/min离心10min,弃掉上清,用30μL灭菌双蒸水重悬菌体细胞,细胞悬液煮沸10min,再冰浴10min,12000r/min离心1min,取上清作为PCR模版进行PCR鉴定。结果鉴定1.aroA基因前后臂片段的扩增:如图6所示,电泳结果显示有一条约700bp的条带,与预期的710bp的片段一致。用引物ΔaroA-3/ΔaroA-4从H10菌株的基因组中扩增aroA基因的后臂ΔaroA-DN,电泳结果显示有一条约1200bp的条带(图6中的B图),与预期的1281bp的片段一致。PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序,测序结果与副猪嗜血杆菌参考菌株SH0165序列(GenBankxa0No:U05042)比对同源性为99%。2.菌株H10aroA、omP2基因前后壁的克隆鉴定结果:如图7所示,电泳显示3个PCR结果为阳性的克隆子的质粒双酶切都产生了两个条带,一条约700bp,另一条约为3000bp,与预期的710bp的片段和2961bp的载体一致,将这3个质粒再用NotI和SalI双酶切鉴定,结果显示只有1个质粒产生了预期的条带,即700bp和2961pb,证明片段ΔaroA-UP以正确的顺序连接到了pMD18-T上,而另外2个质粒都只产生了一个3500bp左右的条带,即质粒pMD18-T和片段ΔaroA-UP连接而成。将两次酶切都产生两个条带的克隆子送上海生工生物工程有限公司测序,测序结果与副猪嗜血杆菌参考菌株SH0165序列(OenBankxa0No:U05042)比对同源性为99%;PCR结果为阳性的克隆子抽提质粒进行酶切鉴定,pMD18-T-ΔaroA-DN用BglII和SalI双酶切鉴定,电泳显示3个PCR结果为阳性的质粒双酶切产生了两个条带,一条约1300bp,另一条约xa0为3000bp,与预期的1281bp的片段和2961bp的载体一致。选取酶切结果较好的2号克隆子送上海生工生物工程有限公司测序,测序结果与副猪嗜血杆菌参考菌株SH0165序列(GenBankNo:U05042)比对同源性为99%。3.中间转移质粒pMD18-T-ΔaroA、pMD18-T-ΔompP2的电泳结果:如图8所示,A表示电泳结果产生了明亮而单一的条带,大小为2000bp,与预期大小1991bp一致;B表示酶切结果正确的克隆子送上海生工生物工程有限公司测序,测序结果与副猪嗜血杆菌参考菌株SH0165序列(GenBankNo:U05042)比对同源性为99%,并将两个片段ΔaroA-UP与ΔaroA-DN连接到了一起,中间去掉了500bp的核酸序列。4.重组自杀性质粒pEMΔaroA、pEMΔomP2结果鉴定:如图9所示,A表示测序正确的Pmd-18-T克隆子抽提质粒,并用NotI和SalI双酶切,胶回收小片段,大小约为2000bp(即片段ΔaroA-UP-DN),自杀性pEMOC2同样用NotI和SalI双酶切,回收大片段,大小约为8300bp;B表示结果为阳性的菌落抽提质粒NotI和SalI双酶切鉴定,酶切产物经电泳后观察到两个条带,大小约为8300bp和2000bp,与预期的8375bp和1991bp两个条带一致,证明片段ΔaroA-UP-DN已经成功连接到了自杀性质粒pEMOC2上,酶切结果正确的克隆子送上海生工生物工程有限公司测序,测序结果显示ΔaroA序列与副猪嗜血杆菌参考菌株SH0165序列(GeneBankxa0No:U05042)比对同源性为99%,并且使aroA基因中部位置成功缺失掉500bp的核酸序列。5.ompP2基因上下游片段的扩增结果鉴定结果:如图10所示,用引物ΔOmp2-1/ΔOmp2-2从HS01的基因组中扩增omp2基因的上游片段omp2-上,电泳结果显示有一条约770bp的条带,与预期的775bp的片段一致;如图11所示,用引物ΔOmp2-3/ΔOmp2-4从HS01的基因组中扩增omp2基因的下游片段omp2-xa0下,电泳结果显示有一条约1,000bp的条带,与预期的1,044bp的片段一致。PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序;测序结果显示正确。6.中间转移质粒pMD18-T-Δomp2鉴定结果:图12显示,最终将两个片段Δomp2-UP与Δomp2-DN连接到了一起,中间去掉了384bp的核酸序列。7.自杀性质粒pEMOC2-Δomp2的构建结果见图13和图14。8.单基因缺失株HS02的筛选和鉴定:如图15所示,转化了质粒pEMΔaroA的E.coilβ2155与HPS亲本菌HS01接合转移后,发生同源臂间的单交换,质粒pEMΔaroA整合到HS01染色体上,阳性接合子表型为CmR,用引物Cm-1和Cm-2可以从接合子中扩增出重组质粒上700bp左右的Cm基因片段;如图16所示,质粒整合到染色体上后,aroA的前后臂将有两个拷贝,一个是缺失型,一个是野生型,因此用上臂内部引物paroA-1和下臂内部引物paroA-2可以扩增出两个片段,野生型是2491bp,缺失型是1991bp;如图17所示阳性接合子在无抗性低营养的TNB中培养过夜,筛选CmR并失去了粘液状表型的蔗糖抗性的菌落,用引物paroA-1和paroA-2扩增鉴定。发生第二次同源重组,可以产生两种结果,一种是得到突变株,一种是回复野生型。正确的突变株用paroA-1和paroA-2只能扩增出缺失型的1991bp的片段;如图18所示,得到的单基因缺失株HS02在TSA平皿上传10代,每代都用paroA-1和paroA-2鉴定遗传稳定性。结果显示连续传10代,都只能扩增出缺失型的1991bp的片段;说明HS02中aroA的缺失是很稳定的。9.双基因缺失株HS03的筛选和鉴定:如图19所示,转化了质粒pEMΔomp2的E.coilβ2155与单基因缺失株HS02接合转移后,发生同源臂间的单交换,质粒pEMΔomp2整合到HS01染色体上,阳性接合子表型为CmR,蔗糖敏感,用引物Cm-1和Cm-2可以从接合子中扩增出Cm,质粒整合到染色体上后,omp2xa0的前后臂也有两个拷贝,一个是缺失型,一个是野生型,因此用上臂内部引物pomp2-1和下臂内部引物pomp2-2可以扩增出两个片段,野生型是1007bp,缺失型是623bp;如图20所示,阳性接合子在无抗性低营养的TNB中培养过夜,筛选CmR并失去了粘液状表型的蔗糖抗性的菌落,用引物pomp2-1与pomp2-2扩增鉴定,说明正确的突变株只能扩增出缺失型的623bp,并用Cm-1和Cm-2扩不出Cm;如图21所示,得到的缺失株HS03在TSA平皿上传10代,每代都用pomp2-1与pomp2-2鉴定遗传稳定性,结果显示连续传10代,都只能扩增出缺失型的623bp的片段,说明HS03中的omp2的缺失是很稳定的。10.突变株生物学特性的研究:副猪嗜血杆菌突变株HS02、HS03和亲本株HS01的生长曲线如图22所示,从生长曲线可见突变株和亲本株的生长并没有显著不同,这表明aroA和omp2基因的缺失并没有影响HS01的生长速度。11.缺失菌株对豚鼠的毒力试验及LD50的测定:单基因缺失株HS2、双基因缺失株HS03、亲本株HS01接种豚鼠7天后的死亡情况见表2。死亡豚鼠肺脏无菌接种TSA(NAD)平板回收细菌,分离鉴定均为NAD依赖的细菌,用HPS引物扩增鉴定,均能够扩增出预期1050bp特异性条带(如图23),表明豚鼠是因感染HPS而死亡的;根据寇氏(Korber)法计算细菌的LD50,结果见表2,结果表明:单缺失株HS02比亲本菌的毒力降低了至少70倍,双缺失株HS03比亲本菌毒力降低了至少600倍。说明本发明构建的缺失株比亲本菌毒力极大的减弱了。表2:缺失菌株和亲本菌株对豚鼠的毒力试验ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>12.双缺失株HS03对豚鼠的免疫效力试验:HS03免疫组每只豚鼠腹腔免疫活菌含量为1×109CFU的0.2mLxa0HS03TSB培养液,灭活疫苗免疫组每只豚鼠腹腔免疫灭活疫苗0.2mL,TSB对照组每只豚鼠腹腔注射0.2mLxa0TSB培养基作为未免疫的对照。一免后两周二免,二免后两周攻毒,攻毒的血清型和剂量以及攻毒后豚鼠的死亡情况和保护率见表3。未免疫组在低剂量的攻毒下在24h之内全部死亡,死亡豚鼠肺部有出血,从心血和肺脏能分离攻毒用HPS,说明攻毒的剂量是完全致死的。对于低剂量的攻毒,HS01免疫组和灭活疫苗免疫组都得到了100%的保护,攻毒后2天豚鼠出现精神沉郁、食欲减退、扎堆,第三天恢复正常。而在高剂量的攻毒下,HS01对同源的攻毒可以达到100%的保护。而灭活疫苗免疫组攻毒的保护率分别为50%和100%,死亡豚鼠剖检可见肺部出血,攻毒后2天豚鼠出现精神沉郁、食欲减退、扎堆、第3天逐渐回复正常。结果显示HS03可以对豚鼠提供比灭活疫苗更为有效的保护。表3:双缺失株HS03对豚鼠的保护性试验ntent="drawing" img-format="jpg" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>上述实施方式仅为本发明的优选实施方式,不能以此来限定本发明保护的范围,本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="420"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="413"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="340"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="331"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="415"/>